Nel III secolo, durante la dinastia degli imperatori Severi, l'area in cui sorge la basilica era parte di una villa imperiale denominata Horti Variani ad Spem Veterem, della quale facevano parte l'Anfiteatro Castrense, il Circo Variano e le Terme Eleniane (così denominate dopo il restauro dell'imperatrice Elena).

Nel 324, quando Costantino trasferì la capitale dell'impero a Costantinopoli, la residenza restò proprietà di sua madre Elena, che fece edificare all'interno della residenza una cappella per la conservazione delle reliquie della passione di Gesù Cristo, da lei stessa riportate a Roma dopo un viaggio a Gerusalemme nel 325. Tale cappella divenne poi il nucleo originario dell'attuale basilica di Santa Croce, per questo chiamata in origine "Basilica Eleniana".

Diversi furono gli interventi che la chiesa subì nel corso dei secoli. La fondazione di un monastero a Santa Croce risale al X secolo, come attesta l'epigrafe funeraria di Benedetto VII posta accanto all'ingresso principale della basilica.
Durante il pontificato di papa Lucio II, nel XII secolo, si ebbe la trasformazione della chiesa secondo lo stile medievale che ritroviamo ancora oggi nella disposizione a tre navate, con l'aggiunta di un campanile a torre in stile romanico.

Nel febbraio 1492, durante il restauro di un mosaico, venne scoperta una cassetta murata nell'arco absidale della chiesa contenente una tavoletta in legno di noce custodita all'interno di un astuccio in piombo con i tre sigilli del cardinale Gerardo Caccianemici, il futuro papa Lucio II (1144-1145). La reliquia riporta un'iscrizione in tre lingue – ebraico, greco e latino – ed è il Titulus Crucis: "Iesus Nazarenus Rex Iudaeorum", "Gesù Nazareno re dei giudei", che conosciamo anche dalla sigla I.N.R.I.

L'attuale aspetto della basilica si deve alla ristrutturazione effettuata per volontà di Benedetto XIV tra il 1740 e il 1758 dagli architetti Pietro Passalacqua (1690-1748) e Domenico Gregorini (1692-1777), che modificarono in modo definitivo la facciata della chiesa secondo lo stile tardo barocco. La facciata è divisa in tre campate, di cui la centrale convessa e le laterali concave; sulla sommità, nella parte centrale, troviamo le statue degli Apostoli, a destra Costantino e a sinistra Elena, al centro due angeli adorano la Croce.

Le reliquie fino al 1930 erano custodite nella cappella sotterranea di sant'Elena; oggi invece si trovano in una cappella ricavata nella navata di sinistra, progettata da Florestano Di Fausto e accessibile dal 1930.
La Cappella delle Reliquie, detta anche Santuario della Croce, custodisce tre frammenti della Croce di Gesù Cristo, ritrovati, secondo la tradizione, da sant'Elena sul monte Calvario a Gerusalemme, il Titulus Crucis rinvenuto nel 1492 nell'abside della basilica e altre reliquie di minore importanza aggiunte negli anni successivi.

L'interno della basilica è il risultato dei rifacimenti e delle ristrutturazioni avvenuti nel corso dei secoli, che ritroviamo nell'impianto medievale e nelle decorazioni barocche. Le tre navate sono separate da otto antiche colonne di granito e da sei pilastri, quattro dei quali inglobano altrettante colonne originarie realizzate nel Settecento.
Gli affreschi dell'abside sono attribuiti ad Antoniazzo Romano e a Marco Palmezzano e colpiscono il visitatore per l'azzurro intenso e l'oro. Il ciclo pittorico illustra le vicende del ritrovamento delle reliquie da parte dell'imperatrice.

Al Settecento risalgono alcune opere di Corrado Giaquinto: nel soffitto della navata centrale troviamo la tela della Madonna che presenta sant'Elena e Costantino alla Trinità (1744), nella volta del presbiterio la tela dell'Apparizione della Croce, sulla parete dell'abside gli affreschi Mosè fa scaturire l'acqua dalla roccia e Mosè e il serpente di bronzo.

Annesso al monastero di Santa Croce e ricavato tra le Mura Aureliane e la chiesa vi è l'antico Anfiteatro Castrense, costruito nel III secolo e utilizzato come giardino della basilica e del convento.
Alle spalle della basilica si possono invece ammirare i resti del Circo Variano, in cui si tenevano i giochi gladiatori e le corse dei carri.